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Procedimiento de aspiración folicular (OPU)

Para llevar a cabo la técnica de aspiración folicular in vivo se requiere contar con un equipo de ecografía, un transductor sectorial, una bomba de aspiración controlable y un sistema guía de la aguja.

Equipo OPU

El transductor lineal es sin duda el más utilizado en reproducción de animales grandes. La principal desventaja de su utilización en OPU, se refiere al limitado espacio entre el transductor y la aguja, lo que impide que todas las regiones del ovario sean puncionadas, incluso para cambiar la posición de los ovarios.

En la actualidad se utiliza  el transductor convexo o sectorial, por su versatilidad,  facilidad y eficiencia en la fijación  y el cambio de posición del ovario, así como una mejor apreciación de folículos pequeños en comparación con el transductor lineal.

La sonda ecográfica para OPU ha sido adaptada para permitir la fijación y manipulación del ovario, de tal manera que este en contacto estrecho con el transductor y a su vez permita que la punta de la aguja pueda visualizarse cuando penetra dentro del folículo a ser aspirado.

Para la aspiración se emplean agujas hipodérmicas desechables de calibre 18 – 19  y 40 – 50 mm de longitud. Las agujas con calibres superiores a 18 están relacionadas con mayores tasas de recuperación, pero con un porcentaje mayor de ovocitos desnudos, así como importantes daños al estroma y una mayor cantidad de sangre en el líquido aspirado. Las agujas de diámetro inferior a 18 han reducido las tasas de recuperación de ovocitos, posiblemente por la lentitud de la aspiración del líquido folicular en el momento de la punción.

Contrario a las expectativas sobre que el bisel corto sería más eficiente, más fácil y rápido de introducir en el interior del folículo, se ha reportado  una mayor recuperación y calidad de los ovocitos cuando se utilizaron agujas con bisel largo. La razón sería que el corte del bisel   largo permite una superficie más amplia de la punta de la aguja lo que facilita la penetración dentro del folículo y evita la posibilidad de fuga del contenido folicular.  (SENEDA)

La frecuencia del transductor es una variable importante en el proceso de recolección de ovocitos [26]. Hay citas de 3,5 MHz de frecuencia [8], de 7,5 MHz [27, 47], 5,0 MHz [1,16,41] y 6,5 MHz [28,45].

Procedimiento anestesia

En primer lugar, al iniciar el trabajo, las hembras a utilizar deben sedarse con xilazina y además recibir anestesia epidural con lidocaina al 2% (3-5 ml/vaca). Luego se  procede a limpiar y desinfectar la vulva y el  periné.

Localizacion del ovario

Se  introduce  el  transductor dentro de la vagina, hasta el fornix vaginal, ubicando la cabeza del mismo en el lado del ovario a puncionar. Luego se introduce la mano izquierda por el recto y se retrae el ovario, fijándolo contra la cabeza del transductor.

Puncion

Luego de ubicar el ovario a aspirar, se impulsa la aguja suavemente para que penetre la pared vaginal y luego la folicular. Una vez logrado esto la bomba de vacío aspira el contenido y lo deposita en el filtro de embriones o en el recipiente destinado para tal fin. En cualquiera de los casos estos deben contener medio de aspiración heparinizado (PBS+10% de suero fetal bovino).

Aspirado

En la pantalla del ecógrafo podemos ubicar y visualizar los folículos, así como apreciar la trayectoria de la aguja, la aspiración del contenido folicular,  la reducción del espacio ocupado por el folículo y el éxito de la aspiración.

Recoleccion

Luego de completar la aspiración de los folículos en cada uno de los ovarios, los ovocitos son depositados en un  recipiente y con posterioridad ser seleccionados para su consecuente maduración.

SELECCIÓN DE OVOCITOS. 

El desarrollo in vitro de los ovocitos está íntimamente relacionado con la aptitud que adquieren durante su etapa folicular previa, lo que se denomina maduración ovocitaria. El folículo es una estructura ovárica con dos funciones, producción de hormonas y de ovocitos aptos para ser fecundados. Las mismas son llevadas a cabo por los folículos antrales, los cuales poseen una pared interna de células de la granulosa que se apoyan sobre la membrana basal. Esta matriz extracelular separa las capas epiteliales del mesénquima y afecta la migración celular, proliferación y diferenciación de las células que se apoyan en ella.

cLASIFICACION ovocitos

La selección de los ovocitos se realiza generalmente en base a tres criterios: el diámetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las características del cúmulo que los rodea. El diámetro de los ovocitos condiciona su capacidad para madurar  de tal forma que los ovocitos bovinos con un diámetro inferior a 110 μm se encuentran todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad para madurar.

Los ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias capas de células, presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y  desarrollo hasta blastocistos, que los que carecen de cúmulo o los que están rodeados solamente por la corona radiata.

Diversos autores han tratado de establecer una relación entre el aspecto del citoplasma y la competencia del ovocito para madurar, ser fecundado y soportar el desarrollo posterior. Así, se ha comprobado que los ovocitos que presentan un ooplasma oscuro muestran una acumulación de lípidos y un buen potencial para el desarrollo, mientras que los que presentan un citoplasma pálido tienen una baja densidad de orgánulos y escaso potencial de desarrollo. Por otra parte, cuando el ooplasma es negro, los ovocitos están envejecidos y tienen un potencial muy bajo para soportar el desarrollo (Nagano et al., 2006)  (HERRADON).

El potencial de maduración, fecundación, capacidad de desarrollo embrionario de los ovocitos se puede estimar por la aparición de células del complejo cumulus oophorus (COC), con la siguiente clasificación.

Ooplasma

Grado I (GI) – Cumulus compacto, que contiene  más de tres capas de células. Ooplasma con granulaciones finas y homogéneas, que llenan el interior de la zona pelúcida  y capa de color marrón.

Grado II (GII) – Cumulus compacto que rodea completamente el ovocito, con menos de tres capas de células. Ooplasma con granulaciones distribuidas heterogéneamente, que pueden estar más concentradas en el centro y más claro en la periferia o condensadas en un solo lugar en donde se ve una mancha oscura.

Grado 3

Grado III (GIII) – Oopplasma contraído, con  espacio entre la membrana celular y la zona pelúcida, llenando el espacio perivitelino de manera irregular.

Vacuolas

En este grupo se encuentran:

  • Desnudos – No cubiertos por células del cúmulo   o cubiertos en parte por ellas.
  • Degenerados – Con  ooplasma vacuolizado o  fragmentado.
  • Atrésicos – Cumulus oophorus oscuro o con presencia de signos de degeneración.

MADURACIÓN DE OVOCITOS. 

Los ovocitos una vez  retirados de los ovarios, no están aptos aún  para ser fecundados y comenzar el desarrollo embrionario inicial, por lo que es necesario que sufran una  serie de modificaciones estructurales y bioquímicas en el núcleo –Maduración Nuclear- y  citoplasmática – Maduración Citoplasmática-  para poder adquirir la capacidad de ser fecundado, lo que en conjunto se denomina Maduración Ovocitaria.

La maduración del ovocito es la última de una serie de etapas que debe atravesar una célula germinal femenina para adquirir la capacidad de ser fecundada y dar origen a un nuevo individuo. Durante esta última etapa el ovocito sufre profundos cambios a nivel nuclear y citoplasmáticos que son regulados paracrinamente por una compleja comunicación bidireccional con las células somáticas que lo rodean. Esta regulación local es coordinada por factores endocrinos que son secretados en forma cíclica. Como resultado de la interacción entre los diferentes niveles de regulación, paracrina y endocrina, solo unos pocos ovocitos son seleccionados para iniciar la etapa de maduración a lo largo de la vida fértil, mientras que la mayor parte degeneran en atresia. Al final de la etapa de maduración ocurre la ovulación, y el ovocito es, durante un corto período de tiempo, una célula completamente competente capaz de dar origen a un nuevo individuo si es fecundada en un momento determinado. (LATTANZI).

La maduración nuclear y citoplasmática debe ocurrir simultáneamente confiriéndole a los  ovocitos la capacidad de ser fecundados además de poder descondensar la cabeza del espermatozoide, formar los pronúcleos y  el desarrollo normal del embrión.

mADURACION

Los eventos nucleares consisten en la reorganización de la red de microtubulos, rompimiento del envoltorio nuclear,  descondensación de los cromosomas y progresión a la Metafase I, Anafase I, Telofase I, expulsión del primer cuerpo polar y llegar al estado de Metafase  II.

En cuanto al  citoplasma, ocurre la reprogramación  de la síntesis proteica, así como la activación de la proteinquinasa por los Mitógenos (MAPK) y el Factor  Promotor de la Maduración (MPF). Igualmente se  desencadenan  los mecanismos de liberación de Ca++ y la adquisición de la capacidad de descondensar la cabeza del espermatozoide.

Además durante este período ocurren cambios en la reorganización del citoplasma  tales  como el desarrollo  continuo de los niveles lipídicos, reducción del aparato de Golgi, aparición de los ribosomas  adyacentes a los cromosomas, migración de las mitocondrias y alineamiento de los gránulos corticales próximos a la membrana plasmática. El aumento de los niveles lipídicos está asociado a la formación de un pool de energético esencial para que el ovocito  pueda  desarrollarse  después  de  la  fecundación.

Otro evento que ocurre durante  la maduración ovocitaria es la expansión de las células del cúmulo que circundan al ovocito, las cuales son células especializadas de la granulosa asociadas metabólicamente entre sí y con el ovocito. Las proyecciones de las células del cúmulo atraviesan la Zona Pelúcida y forman pequeñas uniones con el ovocito. Estas uniones son la única entrada de sustancias que estimulan el plasma. En el ovocito inmaduro estas células están muy compactas y durante la maduración se inicia la secreción de ácido hialurónico, el cual se deposita entre  ellas separándolas y originando su  expansión.

La expansión de las células del cumulo y la aparición de los cuerpos polares son los síntomas más significativos  de que  la  maduración del  ovocito sigue un curso normal.

Existe una relación entre el diámetro del folículo y el desarrollo del ovocito  y su capacidad de desarrollo in vitro. Así ovocitos procedentes de folículos pequeños (1-2 mm) logran la maduración nuclear pero son inmaduros citoplasmáticamente.

De otra parte ovocitos procedentes de folículos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm) tienen un mayor porcentaje de lograr la maduración nuclear y alcanzar el estado de blastocisto. La competencia meiótica aparece cuando  el ovocito alcanza el 80-90% de su tamaño, pero hasta,  que no alcanza su tamaño máximo no puede completar la maduración citoplasmática.

La tasa de maduración nuclear aumenta con el diámetro del ovocito, lo que sugiere que los ovocitos con diámetro inferior a 110 µm están aún efectuando la síntesis de ARN y por consiguiente todavía se encuentran en fase de crecimiento y por consiguiente no han completado la maduración nuclear y  citoplasmática en el momento de la FIV. Cuando el diámetro ovocitario supera los 110 µm la mayoría de los ovocitos se desarrollan hasta MII. (GONZALEZ).

TABLA

Se aprecia la relación existente entre el tamaño del  folículo y el ovocito y su capacidad para alcanzar su desarrollo a MII. Todos estos eventos que tienen lugar normalmente en el animal, deben llevarse a cabo a nivel  de  laboratorio durante el proceso de Maduración  IV.

Una vez seleccionados  los  ovocitos son  colocados  en un medio de maduración  e incubados  a   38°C   durante 24 horas en un ambiente de alta  humedad, 5% de CO2 y protegidos  de la luz. Una vez  trascurridas  las  24  horas  de la MIV, los  ovocitos maduros  (MII), están   preparados  para  su  fecundación.

Artículo enviado a Prosegan por: Dr. Miguel Germán Rivera Gaona | Email: cuchacho@hotmail.com

Un comentario

  1. Arnoldo Hernandez Demara

    Hola, soy Médico Veterinario y me interesa mucho aprender FIV, ojalá pudieran brindarme capacitación, por favor mándeme cotización a mí E-Mail. Gracias.

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