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¿Qué es la vitrificación de embriones?

Además de la criopreservación de los embriones PIV, por métodos convencionales, en los últimos años se ha desarrollado  una nueva técnica  denominada Vitrificación. La Vitrificación a diferencia de la congelación lenta, es la solidificación de una solución, mediante el aumento extremo de la viscocidad a bajas temperaturas sin que se formen cristales, proceso realizado por la deshidratación de las células luego de su exposición a altas concentraciones de Crioprotectores (4-8 mol/L), antes de iniciar el enfriamiento ultrarrápido, lo cual es necesario para lograr la vitrificación intra y extracelular. (VAJTA Y KUWAYAMA  2006).

Cuadro 1

rápida (≈2500°C/ min) y necesita de la presencia de los crioprotectores que permiten la formación del “estado vítreo” y  disminuyen los daños químicos y mecánicos causados durante el paso entre los puntos críticos de congelación. (KASAI 2004).

Imagen 1

El resultado de la vitrificación está condicionado previamente por dos factores. La calidad del embrión y el estado de desarrollo embrionario. Cuando se congelan embriones de calidades muy buena y buena se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular. La etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación de embriones es mórula compacta a blastocisto expandido, siendo más sensibles a las bajas temperaturas los embriones producidos in vitro. (CELESTINOS 2002).

La etapa de desarrollo del embrión más apropiada para la vitrificación en Etilen Glicol es la mórula compacta y blastocisto temprano tanto en los producidos in vivo como in vitro. Otro aspecto a considerar es la calidad de los embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular.

Para elegir el mejor método de vitrificación se den tomar en cuenta diferentes factores con: Crioprotectores a utilizar, estos deben manejarse en adecuada concentración, adicionarse al embrión en forma creciente y a tiempos determinados, en combinación con otros crioprotectores que sean de baja toxicidad, para que sean utilizados con el menor volumen posible. Temperatura de adición con tasas de enfriamiento lo suficientemente rápidas para evitar la pérdida del equilibrio osmótico y causar daño celular que comprometa la viabilidad embrionaria. (CELESTINOS).

Con respecto a la vitrificación, puede concluirse que los resultados de la viabilidad poscongelado varían según el protocolo y la metodología de la obtención de los embriones. Debido al desarrollo  de  la  técnica de FIV y  su  cada vez mayor utilización en Programas de Fertilización Asistida, se han desarrollado y modificado en el tiempo muchos Protocolos y Técnicas cuya  aplicabilidad depende del estado de desarrollo embrionario, los crioprotectores utilizados y  en gran medida de la habilidad y destreza  del personal especializado.

Cuadro 2

FASE DE EQUILIBRIO. 

Respecto al primer paso  de Exposición del embrión a la solución de equilibrio (SE), los embriones obtenidos entran en contacto con un medio de mantenimiento antes de ponerse en contacto con la solución vitrificante.

En esta fase el contacto del embrión con los crfioprotectores se efectúa en varios pasos, según el protocolo utilizado.

La Solución de Equilibrio (SE) está compuesta por  una Solución Básica (SB) con un  pH estable que oscila entre 7.2 y 7.4, suplementada  con bajas concentraciones de crioprotectores y  diferentes tiempos de  exposición, habiendose reportado valores de 1,5 minutos (VAJTA), 5 min (MARTINEZ 2002; VARAGO 2006; HUANG 2007), 7 minutos (DOBRINSKY) o 10 minutos (MARTINEZ 2006).

Dentro de la Soluciones  Básicas (SB) de medios de cultivo tenemos:

  • Medio de Cultivo de Tejido TCM199.
  • Medio HEPES-buferado.
  • Ham F-10.
  • TCM 199 +HEPES.
  • EFS  (CABRERA 2006).
  • Medio Base (MB) = TCM‐199 w/ y rojo fenol (Cellgro) + 10% Suero Fetal Bovino (SFB) + 5ml/ml   Gentamicina.  (BONILLA  2011)

Sin embargo, el medio simple de Buffer Fosfato Salino (PBS) es el más utilizado, no presentando diferencia significativa en la tasa de reexpansión y eclosión embrionaria con el complejo medio TCM-199 (VAJTA). Otros autores reportan una mayor tasa de desarrollo in vitro en embriones vitrificados con medio a base de PBS suplementado con un medio h-CM (SILVESTRE 2003).

Las Soluciones de Equilibrio están compuestas por  Soluciones Básicas  mezcladas con los diferentes crioprotectores en menores proporciones que las Soluciones Vitrificantes

  • G10%  +  PG 20% en PBS  (SHEFFEN).
  • DMSO 10%  + EG 10% en WS (HAJARIAN 2011).
  • EG 7.5% + DMSO 7.5%  (BONILLA 2011).
  • DMSO 5% (v/v) EG  5% (v/v) en DPBS  (CALOMARDE 2014).
  • EG 10% +  DMSO 10% (vol/vol)  disueltos en SB de PBS Dulbecco suplementada  con 0.2% de Sero Albúmina Bovina  SAB (vol/vol) (JIMENEZ 2016)

Se ha reportado la exposición del embrión en un solo paso (WALKER 2006), dos pasos (VAJTA) y tres pasos (DONNAY).

Los resultados indican que al aumentar el número de pasos de equilibrio antes de la inmersión final en la solución de vitrificación, la viabilidad de los embriones es mayor después de la desvitrificación. Este incremento gradual en la concentración del crioprotector permite que se disminuya el estrés osmótico y el daño celular; sin embargo, el número de pasos en la fase de equilibrio es uno de los puntos críticos que aún impiden que la vitrificación sea utilizada a nivel comercial, ya que el tiempo en cada uno de los pasos puede retrasar el proceso, cuando se trata de vitrificar un número elevado de embriones. (MANJUNATHA 2009)

WALKER 2006 evaluaron las tasas de viabilidad de los embriones in vitro, comparando procesos en los que se adicionaba el crioprotector, en uno o dos pasos. Las tasas de viabilidad embrionaria con un paso fueron inferiores a las obtenidas con dos pasos (85% vs 98%, respectivamente); por lo tanto, el simplificar este proceso para hacerlo en una forma más rápida podría ser inadecuado, para la posterior viabilidad de los embriones.

FASE DE VITRIFICACIÓN. 

Con relación al segundo paso: Contacto del embrión con la solución vitrificante, después de la fase de equilibrio, la SV contiene altas concentraciones de crioprotector, pero el tiempo de contacto del embrión con el crioprotector disminuye considerablemente, puesto que existe un límite biológico en la tolerancia de las células al crioprotector, para evitar su toxicidad y la formación de cristales de hielo. El tiempo de exposición de los embriones con la SV varía entre los reportes dependiendo de los crioprotectores utilizados y el tipo de embrión a vitrificar (mórula o blastocisto).

El periodo de contacto del embrión con la solución vitrificante oscila entre 20-60 segundos  (VARAJO 2006; HUANG J. 2007; MANJUANATHA 2009). Algunos consideran que la viabilidad de los embriones es mayor cuando el tiempo de exposición es menor; sin embargo, WALKER et al. 2006 consideran que tiempos cortos pueden ser insuficientes para permitir que niveles adecuados del crioprotector ingresen al interior de la célula y eviten la formación de cristales de hielo y la posterior muerte celular.

Dentro de las Soluciones Vitrificantes se han empleado:

  • EG20%  + DMSO20%.
  • EG 12.5% + DMSO 12.5% + PBS  75%.
  • DMSO 20% + EG20% + Sucrosa  0.5M en  WS  (HAJARIAN 2011).
  • EG 16.5% + DMSO16.5%  en Medio Base MB (BONILLA 2011).
  • EG 42,5% (v/v)  DEXTRANO 18% (peso/v), SA  1,01M CAROSA en PBSD (CALAMARDE 2014).
  • Medio EFS compuesto por EG40%+ FICOL70 18% + SUCROSA 0.3M  en Medio Independiente CO2 (CIM, Gibco BRL)  (CHRENEK 2014).

FASE DE EMPACADO. 

Con referencia al tercer paso empaque del embrión, se han diseñado varias técnicas para el almacenamiento de los embriones vitrificados, las cuales mantienen  el embrión en contacto estrecho con el nitrógeno líquido, con el fin de obtener tasas altas de enfriamiento y alcanzar el estado vítreo. Estas técnicas permiten el uso de pequeños volúmenes de crioprotector, con la consecuente disminución de la embriotoxicidad. (RIOS) 

Las técnicas de empaque de los embriones ha evolucionado ampliamente desde  el empaque en pajilla plástica convencional de 0.25 cc, pasando luego al empleo de la Pajilla Abierta Estirada o Técnica OPS (Open Pulled Straw). Con posterioridad se han desarrollado otras técnicas de empaque como el “CRYOTOP”, “CRYOLOOP” (KUWAYAMA 2005; LUCENA  2006), el McGILL CRYOLEAF (HUANG 2007), la Super Pajilla Abierta Estirada (Super Open Pulled Straws; SOPS) (YU 2010).

Al minimizar el volumen de la solución de vitrificación en la que están los oocitos o embriones, se aumentan las tasas de enfriamiento y calentamiento, disminuyendose la formación de cristales de hielo. También se disminuye el  daño por chilling que ocurre entre los +15 °C y los -5°C al pasar la muestra rápidamente por este rango de temperatura. La tasa para evitar este daño debe ser de unos 20.000 C/min. Aparentemente con Cryotop se consigue una tasa de hasta 40.000 C/min.

Al utilizar un volumen mínimo de Solución Vitrificante SV de 0.1 ml, al cargar la lámina, se evita el daño por fractura de la zona pelúcida y las membranas celulares, daño que es relativamente común con la congelación por métodos convencionales.

TÉCNICA PAJILLA 0.25ml. 

Figura 2

Inicialmente, se utilizó para la vitrificación la pajilla plástica convencional de 0,25 ml la cual, utiliza volúmenes grandes de crioprotector (>20 μL) En este caso los embriones, luego del equilibrio, son aspirados al interior de la pajilla con soluciones crioprotectoras, separadas en dos compartimentos por burbujas de aire lográndose la vitrificación por inmersión directa en nitrógeno líquido. Con esta técnica se obtuvo un 57% (20 de 35) de reexpansión in vitro en embriones bovinos. (OCHOA 2011).

TÉCNICA PAJILLA ABIERTA ESTIRADA (OPS). 

Figura 3

Posteriormente, Vajta et al 1997 adelgazaron y estiraron por calentamiento la pajilla plástica, hasta alcanzar un diámetro interno de 0,7- 0,8 mm y desarrollaron la denominada Pajilla Abierta Estirada OPS (Open Pulled Straw).

El tercio central de la pajilla es apoyado y calentado por 30 segundos sobre la esquina de una placa térmica a 90°C, hasta el evidente reblandecimiento del plástico. Una vez logrado esto, ambos extremos son traccionados en un plano horizontal hasta lograr en la porción central la reducción del diámetro del grosor de la pared.

Luego, se cortan   las pajillas con un bisturí en la sección delgada, para ser esterilizadas utilizando luz ultravioleta y almacenadas hasta su utilización. El volumen de solución crioprotectora que contendrá el extremo delgado de la pajilla será de 2µl, correspondientes al volumen de la gota desde la cual el embrión será cargado por capilaridad (SILVA 2004)

En la actualidad se cuenta con OPS ® MINITUB, producidas comercialmente.

Cuadro 3

Este adelgazamiento de la pajilla permite utilizar un menor volumen de crioprotector y la tasa de enfriamiento pasa de 2500°C/min, obtenidos con las pajillas convencionales, hasta los 20.000°C/min, obtenidos con la OPS. Con este sistema, el embrión es cargado en el medio de mantenimiento (volumen 0,5μL – 1μL), por la parte más fina de la pajilla, y por capilaridad asciende en una columna líquida de 2 a 3 cm  y un volumen de 1 a 1.5 ml  e inmediatamente, es sumergido en nitrógeno líquido, quedando en contacto directo con  él  durante el periodo de almacenamiento, o Sistema de Almacenamiento Abierto OPS (CELESTINOS & GATICA 2002).

Al evaluar esta técnica de vitrificación OPS en embriones bovinos producidos in vivo, se obtuvo una tasa de reexpansión del 84,6% (33 de 39) y una tasa de eclosión del 66,6% (26 de 39), mientras que embriones bovinos producidos in vitro presentaron una tasa de reexpansión de 52% (27 de 52).(SAALFELD  2002).

Sin embargo, esta exposición directa con el nitrógeno y la posibilidad de contaminación con patógenos virales durante el almacenamiento obligaron a desarrollar nuevos Sistemas de Almacenamiento Cerrado CPS, eliminando el riesgo de contaminación. (BIELANSKI 2003).

A partir de allí, se desarrollaron otras técnicas con el fin de reducir el volumen del crioprotector utilizado en  la vitrificación.

TÉCNICA CRYOTOP. 

Figura 4

El Cryotop ®  es un método de vitrificación de volumen mínimo. Está compuesto por una lámina especial de polipropileno delgado y estrecho (0.4 mm de ancho, 20 mm de largo, 0.1 de espesor) unida a soporte plástico duro. Con el fin de proteger el soporte del daño mecánico durante el empaque, se protege con una funda plástica larga de 3 cm; en esta funda se inserta la lámina de propileno.

El CRYOTOP® con un volumen de 0.1 μl enfría  a un  promedio de 69.25 ± 4,280°C/min de 20°C a – 120°C cuando se introduce directamente en nitrógeno líquido y se calienta desde los −170°C to −30°C a un promedio de 117,500 ± 10,630°C/min, cuando se transfiere abruptamente del  nitrógeno líquido a una solución de 2 ml de Sucrosa a 23°C.

Con base en los resultados de  altas  tasas de  supervivencia y desarrollo en la gran mayoría de las especies  como Porcinos (USHIJIMA 2004), Bovinos (MORATO 2008), Murinos (LING 2009), Búfalos (LIANG 2012), Humanos (ROY 2014) y Conejos (MARCO-JIMENEZ 2016),  el método CRYOTOP®  ha  sido considerado  como   la  llave maestra de la vitrificación.  (MARCO-JIMENEZ  2016).

Con el método de Cryotop se puede utilizar una gran variedad de medios de equilibrio, vitrificación, dilusión, de acuerdo a los requisitos específicos de cada especie o el estado de desarrollo del embrión, así como el criterio y experiencia del Profesional.

En general una proporción equimolar de EG y DMSO suministra una combinación efectiva, usando un método de equilibrio y vitrificación en varios pasos y una suplementación de sacarosa en la concentración final de desvitrificación. El EG es considerado como un componente estandar de las soluciones de vitrificación de mayor éxito. La combinación con DMSO se utilizó por primera vez por Ishimori y colaboradores, observandose un aumento de la permeabilidad del EG. (VAAMONDE 2010).

Con el CRYOTOP ® se han desarrollado dos  técnicas de empaque, el  Sistema Abierto  y el  Sistema Cerrado (CRYOTOP ® SC), el cual permite el sellado del dispositivo dentro de una pajilla completamente cerrada, con el fin de efectuar la vitrificación sin que el CRYOTOP ® entre en contacto con el nitrógeno líquido.

TÉCNICA DE CRYOLOOP O CPIL. 

Figura 5

El Cryoloop  o CPIL está compuesto por un dispositivo   de plástico  suave flexible desechable (nylon),  de 0.5 a 0.7 mm de diámetro, junto con una funda, de un vial de congelación. Este dispositivo es un asa utilizada en microbiología para recolectar y  sembrar muestras de un cultivo de microorganismos.  (SAKI 2005)

Actualmente son fabricados en polipropileno grado médico, esterilizado mediante gases de óxido de etileno.  Están libres de lubricantes, aceites o cargas electrostáticas. Esta dentro de una  bolsa plástica individual. Además el asa está cubierta por  una funda de plástico (pajilla de 3 cm de largo y 0.5 ml) en la punta de la lámina del Cryoloop, para protegerlo  durante el almacenamiento en el termo de nitrógeno, de acuerdo con las regulaciones de la UE  (MARCO-JIMENEZ  2016).

Mientras los embriones son expuestos a las soluciones crioprotectoras, el «cryoloop» es sumergido en la solución crioprotectora, creando una película delgada en  el asa de polipropileno. Luego, los embriones son capturados en dicha película y transferidos hasta el vial, el cual ha sido sumergido y llenado previamente con nitrógeno líquido. (LANE)

Por medio de esta técnica Mukaida et al, reportan 79% de supervivencia post vitrificación en blastocitos humanos. Posteriormente, se han publicado nuevas variantes de esta técnica, denominando a la nueva versión «cryoloop-straw», con la cual se han reportado resultados similares a los obtenidos con la técnica «cryoloop» convencional.

Tabla 1

En un estudio realizado por MARCO-JIMENEZ 2016, se comparó  la eficiencia de la vitrificación de embriones in vitro de conejas, mediante el empleo de  dispositivos Cryotop, Cryoloop y embriones frescos, en cuanto a la tasas de desarrollo e implantación, tasa de nacimientos al parto y perdidas embrionarias y fetales, encontrándose  que la tasa de eclosión de embriones in vitro fueron similares.

Igualmente se confirmó que la técnica de Crotop y Cryoloop son iguales de efectivas en cuanto a tasas de preñez y nacimientos al parto, resultados  que son similares a otros estudios previos.

Tabla 2

Adicionalmente, los resultados obtenidos en este estudio sobre el efecto de estos dispositivos en relación con las pérdidas embrionarias y fetales mostraron que no hay diferencia significativa entre Cryotop y Cryoloop. Sin embargo, las perdidas embrionarias fueron mayores en los grupos vitrificados con relación al grupo de embriones en fresco.

Se encontró así mismo, un pico de pérdidas embrionarias después de la vitrificación y antes de la implantación, pero después de la implantación hasta  el final de la gestación, ambos grupos de dispositivos y el grupo de frescos se comportaron de forma similar.

Además de los sistemas de empaque descritos se han desarrollado otros como

  • Tamaño Mínimo de la Gota (MDS).
  • Rejillas para Microscopía Electrónica (EM).
  • Volumen Mínimo de Congelación (MVC).
  • Sistema de Hemi-pajilla (SHP).
  • Superficie Sólida de Vitrificación. (SSV).
  • Puntas gel-loading tips. 
  • Pajillas Estiradas Cerradas closed-pulled straws (CPS).
  • Mallas de nylon.
  • Pipetas Flexibles, flexipet denuding pipette (FDP).
  • Pajillas Estiradas Abiertas Superfinas superfinely OPS (SOPS).
  • Micropipetas Plásticas de Diámetro Fino.
  • Puntas de Pipeta de 100 μL  (RODRIGUEZ 2010)

El plástico debido a sus características físicas, tiene una baja conductividad de calor, que limita las tasas de congelamiento, por lo tanto el uso de otros materiales con mayor conductividad como el vidrio, metal  o el cuarzo, permiten aumentar el intercambio de calor y las tasas de enfriamiento, alcanzando velocidades de casi 30.000°C/min. Varios autores, demostraron esta eficiencia, al alcanzar mayores tasas de congelamiento con micropipetas de vidrio (GMP) en comparación con las OPS, y mayores tasas de supervivencia post-vitrificación, debido a una mayor conductividad y la utilización de un menor volumen de crioprotectores. (RODRIGUEZ 2011).

Tabla 3

Al evaluar la viabilidad de los embriones utilizando sistemas abiertos (OPS) vs sistemas cerrados (SOPS), YU et al. 2010 no encontraron diferencias significativas en las tasas de viabilidad a las 72 horas post-vitrificación,  35,2% y 34,9%, respectivamente.

FASE DE CALENTAMIENTO / DESVITRIFICACIÓN / DESCONGELACIÓN. 

Para la denominación de este proceso en los protocolos  de  vitrificación, se  han  empleado los términos descongelación, desvitrificación y calentamiento. Cuando se habla de llevar nuevamente el material biológico vitrificado a la temperatura ambiente del laboratorio se utiliza el término calentar y no descongelar. Por otra parte, desvitrificación no significa, como parecería, salir del estado de vitrificación para regresar a la temperatura óptima celular o corporal, sino que indica pérdida del estado vítreo pasando al de cristalización, hecho indeseable que puede ser incompatible con la viabilidad celular y embrionaria (CABODEVILA 2001 SHAW 2003).

Estos procesos  tienen como finalidad llevar  el  ovocito o  embrión  a  su  estado estructural antes de la vitrificación. Teniendo  en  cuenta  lo  anterior puede considerarse  esta fase como una  restitución de las células a  su  estado  natural, por lo que se  sugiere emplear este término para denominar  este paso.

Antes de realizar la transferencia, los crioprotectores utilizados deben ser retirados en forma lenta de los embriones, ya que, una vez en contacto con los fluidos uterinos isotónicos, se produce una sobrehidratación que provoca daños celulares irreversibles con ruptura de la membrana celular y la posterior muerte embrionaria. Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol. (CABRERA et al. 2006).

Una vez calentadas las pajuelas, los crioprotectores penetrantes deben ser retirados de los embriones, e inmediatamente, estos deben rehidratarse, por lo que se debe utilizar un buffer osmótico, en una concentración suficiente para alcanzar una osmolaridad ligeramente inferior a la de la solución de vitrificación, para mantener el equilibrio entre la presión osmótica interna y externa. Estas sustancias  buffer son no permeables como la Sacarosa (1M), Sucrosa (0.5 M). El tiempo de exposición del embrión con las soluciones hiperosmóticas decrecientes varía entre 3 y 5 min por paso (MARTINEZ 2006). Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol EG.

Otros autores como Díez, C, et al, 2004 destacan que la desvitrificación requiere diluir y retirar el agente crioprotector antes de transferir el embrión. Los embriones pueden ser diluidos a través de dos métodos, bien sea dilución dentro o fuera de la pajuela. (VAJTA 2000).

En la Técnica OPS, para la dilución dentro de la pajuela (in-straw dilution) se utiliza una pajilla de 0.25 ml conteniendo sucrosa 0,2 M, calentada a 39ºC y mantenida verticalmente con el extremo abierto hacia arriba. OPS es  sacada del nitrógeno líquido, y el extremo angosto, que  contienen el  embrión y solución, es deslizado dentro de la pajilla de 0.25 ml, sumergiendo el embrión en la solución de sucrosa, retirando enseguida la OPS. La pajilla de 0.25 ml es cargada en una pistola para realizar la transferencia en la receptora.

Para la dilución fuera de la pajuela (ex-straw dilution), los embriones son colocados en placas  que contienen sucrosa 0,2 M y  luego de 5 min se trasladan a una solución de 0,1 M de sucrosa por 5 min, seguido de dos lavados en medio de mantenimiento, colocando los embriones en pajuelas de 0.25ml para su posterior transferencia.

Las condiciones de manipulación (temperatura ambiental -39ºC, temperatura de las soluciones de desvitrificación -41ºC-, dilución en soluciones con concentraciones decrecientes de sacarosa) son difíciles de establecer en las granjas, extremo muy importante en el caso del ganado vacuno.

El porcentaje de receptoras gestantes, diagnosticadas por ecografía, fue de 64% (7 de 11) para el método de dilución dentro de la pajuela y 40% (4 de 10) para el método de dilución fuera de la pajuela. (CABRERA 2006).

En un próximo artículo explicaré detalladamente las diferentes técnicas de vitrificación de embriones.

Artículo enviado a Prosegan por: Dr. Miguel Germán Rivera Gaona | Email: cuchacho@hotmail.com

2 Comentarios

  1. Muchas gracias Dr. Serrano por publicar estos artículos. Precisamente estaba buscando información sobre vitrificación.

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