Home » Reproducción » Andrología » Criopreservación de células reproductivas

Criopreservación de células reproductivas

Desde  los comienzos de la aplicación de las diferentes Técnicas de Reproducción Asistida uno de los objetivos ha sido el de conservar el mayor tiempo posible la capacidad fecundante de las células germinales reproductivas, así como de los embriones producto de la fecundación de los ovocitos tanto in vivo como in vitro.

Este objetivo se ha logrado mediante distintas técnicas de criopreservación,  que mantienen la viabilidad y funcionalidad celular a temperaturas bajas. La criobiología se refiere a entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biológico es una consecuencia de determinadas reacciones bioquimicas, las cuales se hacen más lentas mediante la aplicación del frío y en consecuencia se prolonga su tiempo biológico, puesto que se hacen más  lentas estas reacciones

Sin embargo, este no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interacción célula-célula inherente en las células a criopreservar. La criopreservación está influida por un elevado número de variables, de forma que ninguna aproximación que contemple sólo uno o parte de los aspectos implicados garantiza una eficacia total.

La criopreservación es el proceso en el cual las células son congeladas a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80°C y 196°C (punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de la célula u organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquimicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.

Cada tipo celular debe ser congelado conociendo el perfil biofísico de la célula, el cual dictará mediante ensayos de permeabilidad y volumen osmóticamente inactivo con diferentes criopreservantes y/o soluciones crioprotectoras (mezcla de crioprotectores penetrantes y no penetrantes) junto con  el mejor protocolo de criopreservación de esa célula. Es importante mantener un sistema de seguridad, que permita la continuidad en nitrógeno líquido y ensayos de control de calidad por medio de pruebas de viabilidad.

La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación, su comportamiento durante la congelación y descongelación definirá los índices de supervivencia de la célula congelada. Los periodos críticos para la supervivencia  celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el período de retorno a condiciones fisiológicas. (AVILA_PORTILLO 2006)

La obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido, puesto que este proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estado de la célula a congelar. Las células tienen diferente tamaño, manejan diferente composición de solutos y en general el éxito de la criopreservación esta inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biológicos congelados.

La congelación de las células vivas es un proceso fisico – quimico complejo de intercambio de agua entre la célula y el medio que la rodea, existiendo un índice de enfriamiento óptimo para cada tipo de células, lo cual depende del tamaño de la célula, la relación entre su superficie y su volumen, su permeabilidad al agua y el  coeficiente de temperatura de  esa permeabilidad. (PALASZ)

El objetivo principal de la criopreservacion es la interrupción del metabolismo por un tiempo determinado arbitrariamente, durante el cual las células se encuentran en una anabiosis artificial (estado de latencia). GORLACH 1998 dice que los momentos más críticos y sensibles de la criopresrevación son el momento de la congelación y descongelación. En esos instantes suceden una infinidad de procesos fisico-quimicos regidos por las diferencias de temperatura y transporte de agua entre las células y el medio. Sin embargo para mantener sus características originales (metabolismo y capacidad de crecimiento) se obtiene únicamente con un crioprotector y de diferentes protocolos de congelación. (OCHOA 2011).

La bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez (décimas de segundo) con la que suceden los cambios osmóticos en los procesos de congelación y descongelación hacen muy difícil el movimiento de moléculas a través de la membrana mediante procesos de transporte activo (dependientes de ATP), la disminución de temperatura desde 25ºC a 10ºC reduce en un 60% la actividad de las bombas dependientes de ATP y la difusión facilitada como transporte y, en consecuencia, los procesos de difusión y ósmosis son los que predominan en los momentos de estrés osmótico.

La difusión es un proceso mediante el cual las moléculas de una sustancia tienden a alcanzar una distribución homogénea en todo el espacio que les es accesible. La magnitud de la tendencia a difundir desde una zona a otra si está presente una membrana que separe las dos zonas está  definida por la ley de difusión de Fick, que relaciona el gradiente entre las dos zonas (gradiente químico o de concentración), las características de la membrana (grosor, área de sección transversa y permeabilidad para un determinado soluto), es directamente proporcional a la superficie (área) de la membrana y a la diferencia de concentración del soluto entre los dos lados e inversamente proporcional al espesor (grosor) de la membrana. La velocidad de la difusión es proporcional a una constante de difusión que depende de las propiedades de la membrana y de cada soluto en particular, un equilibrio puede conseguirse en segundos si la distancia es de micras, pero puede subir a varias horas si la distancia de difusión se incrementa a 7 milímetros.

La ósmosis es un caso especial de difusión en el que es el movimiento del disolvente el que se estudia, y se define en función de los solutos. La ósmosis es el movimiento del agua desde soluciones con baja concentración de soluto hasta soluciones con alta concentración de soluto y la presión osmótica es la presión hidrostática que se genera a través de una membrana semipermeable con un gradiente de concentración a lado y lado, la cual depende del número de partículas de la solución.

La presión osmótica se suele expresar en osmoles y depende exclusivamente del número de partículas disueltas (moles) por unidad de volumen, con independencia de su carga eléctrica, peso o fórmula química. Puesto  que  los productos criopreservados se deben almacenar a temperaturas desde -133°C (vapores de nitrógeno líquido) a -196ºC (nitrógeno líquido), y a que a  estas temperaturas no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo las reacciones químicas y por tanto las dificultades de la congelación no derivan de la permanencia a temperaturas bajas sino de los procesos de congelación y descongelación.

Las lesiones celulares crioinducidas se explica en función del hielo intracelular y el estrés osmótico al que se ven sometidas las membranas celulares durante la congelación.

AGENTES CRIOPROTECTORES ACP. 

Los crioprotectores son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto eutectico de una solución dada, en el cual tal composición solidifica como un elemento puro. El descenso del punto eutectico implica que se alcanzará una concentración de solutos a una temperatura menor, de forma que la célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será menor. (AVILA PORTILLO 2006).

Los crioprotectores difieren en la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad  química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes. (BELASCOAIN 2010).

Los crioprotectores se dividen en dos categorías, permeables o intracelulares y los no permeables o extracelulares.

Los permeables son de bajo peso molecular (BPM) como el Glicerol (G) Etilenglicol, (EG) Dimetilsulfoxido (DMSO) 1-2 Propanodiol (PROH), Propilenglicol (PEG), Etanol y otros alcoholes. Estos crioprotectores al penetrar la célula, reemplazan el agua intracelular minimizando la formación de cristales, regulan la deshidratación y protegen la estructura proteica  del citoplasma.

Los crioprotectores con bajo peso molecular (BPM), al tener una mayor permeabiliad, permiten la reducción de los tiempos de exposición y la concentración, con lo cual se previene el daño osmótico causado en la células. Entre los crioprotectores de BPM, el más utilizado es el Etilenglicol (EG) ya que tiene una mayor velocidad de penetración y, por consiguiente, necesita menos tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico.

Los crioprotectores como el Glicerol y Dimetilsulfóxido deben ser retirados de los embriones antes de ser transferidos, ya que una vez en contacto con los fluidos uterinos isotónicos, se produce una sobrehidratación que provoca daños celulares irreversibles, con la subsiguiente muerte embrionaria debido al shock osmótico consecuencia del rápido pasaje de agua hacia el interior de las células. Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el Etilenglico (CABRERA 2006).

crioprotectores

Los crioprotectores no permeables son a su vez:

  • Azucares de BPM como la Sucrosa, Sacarosa, Glucosa, los cuales deshidratan las células antes de la congelación minimizando la formación de cristales a su vez que estabilizan la estructura de la membrana.
  • Macromoléculas de Alto Peso Molecular (APM) como el Polivinilpirrolidona (PVP), Polivinilalcohol (PVA) Seroalbúmina Bovina (SAB), Ficol. Estos contribuyen a la reducción del crioprotector dentro de las células (KASAY Y MUKAIDA 2004) y protegen en la congelación/descongelación alterando el tamaño y la forma de los cristales (DE LA FUENTE 2009).

De igual forma, la asociación de uno o más crioprotectores con características más estables, permitirá la utilización de soluciones más simples y la reduccioón de su toxicidad específica. De acuerdo con algunos investigadores, la permeabilidad de la combinación de crioprotectores es mayor que la de sus componentes de forma individual (VAJTA Y NAGANY 2006).

Para reducir el daño osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la alta concentración de sales, se está dejando de utilizar G y DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con sacarosa o trealosa que han demostrado ser menos tóxico. El DMSO es muy tóxico a temperatura ambiente, lo que lo hace muy riesgoso y no se recomienda usarlo (BELASCOAIN  2010)

Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los procesos de congelación en general debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos, la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una temperatura de 10°C – 16°C alterando de esta manera las funciones de la membrana y dándole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratación celular que tiene lugar en el proceso de congelación se puede presentar una pérdida de lípidos lo cual afectaría la integridad de la membrana plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas. (SEIDEL 2006)

Hay que tener en cuenta que ningún protocolo de congelación o vitrificación disponible garantiza la integridad total de las estructuras de las células u organismos a criopreservar. Durante el proceso estas estructuras están expuestas a diversos tipos de injurias, las cuales son difíciles de considerar por separado ya que en muchos casos operan en conjunto.

Las crioinjurias podrían deberse a:

Formación de hielo intra o extracelular. Durante el proceso de criopreservación la formación de hielo intracelular puede deberse a tasas de descenso térmico muy altas. Por ello el agua endocelular no tiene tiempo suficiente para alcanzar el medio extracelular, se sobrenfría  y alcanza la  temperatura de  nucleación para finalmente cristalizarse dentro del citoplasma. Por otra parte, si la tasa de ascenso térmico durante la descongelación o calentamiento no es lo suficientemente rápida, es posible que se produzca hielo intracelular como consecuencia de un nuevo pasaje a través de la temperatura de nucleación, o por crecimiento de los pequeños cristales que pudieran haberse generado durante el enfriamiento. Esto puede producirse además, por un desequilibrio entre la concentración del crioprotector y la tasa de descenso térmico. (KASAI)

Acker y McGann concluyeron que la propagación de cristales de hielo entre células adyacentes se establece mediante un proceso denominado “nucleación catalizada por superficie”. Esto contrasta con la teoría de Berger y Uhrik e Inmia y Karisson, quienes sostienen que el hielo intracelular se propaga a través de uniones intercelulares tipo Gap. Sin embargo, otros autores sostienen que durante la criopreservación se generarían fuerzas suficientes como para producir pequeñas lesiones en la membrana plasmática por donde se propagaría el hielo. (MULDREW)

Aumento o disminución excesiva del volumen celular por efecto osmótico. La adición o extracción de las sustancias criopreservantes, así como el propio proceso de congelación (efecto de solución), producen cambios de volumen en las células embrionarias que, dependiendo de la magnitud, pueden afectar su supervivencia postcriopreservación. La disminución del volumen celular por una pérdida importante de agua puede determinar modificaciones en la composición del medio intracitoplasmático. Por otro lado, la deshidratación favorecería la pérdida de ubicación normal de las estructuras citoplasmáticas, aproximándose lo suficiente como para permitir reacciones intermoleculares.

La alta concentración de crioprotectores intracelulares puede determinar que las células embrionarias incorporen agua y aumenten excesivamente de volumen, pudiendo dañar estructuras internas o bien desintegrarse por completo.

Efecto tóxico del crioprotector. El citoesqueleto constituye una compleja red de filamentos proteicos, extendidos a través del citoplasma, que coordinan la organización y el movimiento intracitoplásmico . Sin embargo, los elementos que lo constituyen presentan un comportamiento inestable, en donde las subunidades que lo componen se encuentran en constante recambio. Aunque los crioprotectores son necesarios para minimizar los daños que puedan ocurrir durante la criopreservación, estos compuestos pueden también tener efectos nocivos sobre los embriones por toxicidad química.  (DOBRINSKY)

Otras alteraciones asociadas con la adición de sustancias crioprotectoras son el aumento del espacio perivitelino, el aumento de tamaño mitocondrial y la presencia de vacuolas dentro de las mismas, así como la aparición de signos de degeneración nuclear. Además, el glicerol podría inhibir el sistema Na+ K+ ATPasa, el cual es fundamental para el mantenimiento del gradiente osmótico celular.

Alteraciones de las membranas celulares. Las membranas celulares (plasmática y de organelas) son negativamente afectadas por efecto osmótico durante los procesos de criopreservación y su lesión constituye uno de los indicadores más importantes de muerte celular, Cuando el contenido de agua intracelular disminuye por debajo de 10-20%, los componentes celulares permanecen muy juntos entre sí, pudiendo determinar que las membranas pasen de un estado gel de tipo laminar, a uno hexagonal de Fase II, aunque este proceso también puede producirse por efecto directo del frío. En este estado, formado por pequeños cilindros de agua rodeados por fosfolípidos, las membranas celulares pierden la capacidad para llevar a cabo la mayoría de sus funciones. Otra causa por la cual las membranas pueden lesionarse la constituye la formación de hielo intracelular (ACKER 1998)

Fractura embrionaria o de la Zona Pelúcida. Este tipo de lesiones, probablemente se produzcan debido a diferencias en la expansión de los cristales de hielo (39), lo cual generaría cambios irregulares de volumen en los medios de criopreservación durante un rápido cambio de fase. Según Kasai y col, durante la congelación convencional más del 50% de los embriones pueden ser físicamente dañados si las tasas de descenso-ascenso térmico durante la congelación-descongelación no son adecuadamente ajustadas. Esta lesión es más frecuente durante el calentamiento, y se produciría por el rápido pasaje a través de la temperatura en la cual se forma la fase vítrea (-110 a -135°C). (OCHOA).

Otras crioinjurias. Si bien durante la congelación, los embriones rara vez toman contacto directo con los cristales de hielo, permanecen en la fracción no congelada, donde son expuestos a diversos tipos de estrés físico, tales como:

  • Daño mecánico como consecuencia de la formación de burbujas debido a un aumento de gas soluble
  • Alteración en los procesos de difusión y osmosis, producto de un aumento de la viscosidad.
  • Desnaturalización proteica, debido a cambios de pH.  (MUCCI 2005).

Crioinjurias

Las crioinjurias de diversos tipos son difíciles de considerar por separado ya que en la mayoría de los casos operan en conjunto.

Cada tipo celular debe ser congelado conociendo el perfil biofísico de la célula, el cual contará mediante ensayos de permeabilidad y volumen osmóticamente inactivo con diferentes crioprotectores o soluciones crioprotectoras  a base de mezcla de crioprotectores penetrantes y no penetrantes, el mejor protocolo de criopreservación de esa célula. Es importante asegurar un sistema de seguridad, de continuidad del nitrógeno líquido y ensayos de control de calidad por medio de pruebas de viabilidad. (AVILA-PORTILLO).

Por lo expuesto anteriormente se han desarrollado y constituido diferentes  Escuelas o Técnicas De Criopreservación de Células Reproductivas y Embriones, por los distintos Centros De Reproducción Asistida, tanto desde el punto de vista investigativo como comercial, con resultados variables. La tendencia es la de unificar los diferentes protocolos resultantes, haciéndolos más prácticos, sencillos de ejecutar con porcentajes  de fertilidad y fecundación cada día más altos y rentables, para su aplicación masiva en Producción Animal.

Artículo enviado a Prosegan por: Dr. Miguel Germán Rivera Gaona | Email: cuchacho@hotmail.com

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos necesarios están marcados *