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Congelación de embriones

La producción de embriones ha crecido  de manera sistemática y exponencial, debido a la fertilización in vitro (FIV), simplificación de los protocolos, de criopreservación, utilización de nuevas mézclas de crioprotectores, así como su aplicación en la producción en diferentes especies domésticas, tanto desde un contexto científico como comercial.

La criopreservación de embriones es una técnica que se aplica cuando hay disponibilidad de embriones de excelente calidad que no  son trasferidos en fresco y pueden aprovecharse posteriormente. Su objetivo es el de reducir los procesos metabólicos del embrión a su mínima expresión y que se puedan conservar el mayor tiempo posible, garantizando que en el momento de su utilización, luego de la descongelación, mantengan su viabilidad y por lo tanto lleguen a terminar en una gestación.

Básicamente, la criopreservación embrionaria contempla cuatro etapas:

  1. Suspensión de los embriones en soluciones a la que se les han adicionado  crioprotectores.
  2. Enfriamiento en condiciones tales que eviten la formación de cristales intracelulares cuando se sumergen en nitrógeno líquido (-196 ºC).
  3. Entibiamiento de los embriones a temperaturas fisiológicas para reasumir las funciones.
  4. Remoción de los crioprotectores (dependiendo del crioprotector empleado). (BELASCOAIN 2010).

La criopreservación de embriones tiene ventajas tanto desde el punto de vista biológico como comercial, al facilitar su almacenamiento, transporte y utilización en periodos posteriores a voluntad de los propietarios, ya sea en programas Sincronización de Receptoras y Transferencia De Embriones a Tiempo Fijo, como en programas de trasplante de embriones en receptoras a celo detectado.

Este último programa está siendo implementado por el Laboratorio de Reproducción Animal de Corpoica Tibaitata, bajo la dirección del Dr Aldemar Chavez R. MVZ. 2015, el cual incluye la producción masiva de embriones FIV y el reentrenamiento de los Inseminadores a nivel de finca en las distintas Asociaciones o Comités de Ganaderos a nivel nacional (Informe personal)

La viabilidad de los embriones congelados producidos in vitro, en comparación con los in vivo, es menor probablemente debido a las características físicas propias de este tipo de embriones, que hace que sean más sensibles al momento de ser expuestos a bajas temperaturas.

Numerosos equipos de investigación han demostrado que el embrión FIV es mucho más sensible a la congelación que el producido in vivo. Así, las tasas de gestación tras la transferencia a hembras receptoras de embriones in vivo congelados se acercan a las obtenidas con embriones frescos (60%), mientras que para el caso de los producidos in vitro no se supera el 20-30% de gestaciones. El camino a seguir en el terreno de la criobiología consiste en determinar el origen de las lesiones que se producen en el embrión FIV, así como poner a punto diferentes sistemas que, proporcionen una protección al embrión y  permitan obtener una tasa de desarrollo normal tras su congelación/descongelación.

Entre dichas características, se encuentran diferencias no solo morfológicas sino también fisiológicas, como:

  • El aumento en el número de vacuolas.
  • Mayor fragilidad de la zona pelúcida.
  • Menor compactación embrionaria.
  • Un menor número de blastómeras, sobre todo en la masa celular interna.
  • Alteraciones en la expresión génica.
  • Mayor tasa de apoptosis.
  • Aumento en el alto contenido citoplasmático de lípidos (RODRIGUEZ 2011)

Gran parte de los investigadores centran actualmente sus estudios en este campo, con el fin de encontrar el origen de esta mayor sensibilidad a las bajas temperaturas de los embriones FIV y poder mejorar los resultados obtenidos hasta ahora

Los primeros resultados obtenidos apuntan hacia la existencia de importantes diferencias entre ambos tipos de embriones:

  1. Diferencias estructurales: los embriones FIV parecen tener menor densidad que los obtenidos in vivo, posiblemente debido a su mayor contenido en lípidos. No obstante, no se conoce el mecanismo exacto por el que este hecho podría explicar una mayor sensibilidad al enfriamiento de los embriones FIV.
  2. Diferencias en el metabolismo: los embriones FIV podrían desarrollar diferentes rutas metabólicas que explicarían también el diferente contenido en lípidos. Aunque el contenido en lípidos parece afectar la sensibilidad al frío y alterar la supervivencia embrionaria durante la congelación, existen otros factores como la velocidad de enfriamiento, la edad y el estado de desarrollo de los embriones, características celulares (permeabilidad celular, propiedades osmóticas) y la utilización de diferentes crioprotectores, que también tienen un efecto importante sobre la congelabilidad de los embriones. (DÍEZ MONFORTE).

MÉTODOS DE CRIOPRESERVACIÓN. 

Los principales métodos utilizados para la criopreservación de  embriones son, Congelación Convencional, Congelación Ultrarrápida y la  Vitrificación, con sus respectivos protocolos y variantes. Todos tiene el mismo fin que es conservar la célula o el embrión el mayor tiempo con la mayor fertilidad, pero después del análisis de dichos métodos se puede concluir que a pesar de los cambios que se producen a nivel estructural y metabólico en el post congelado, el de congelación convencional es el más adecuado debido a que se garantiza una mayor eficiencia de los crioprotectores, gracias a la congelación lenta, lo que no sucede con la vitrificación por la violenta congelación del embrión al entrar en contacto con el nitrógeno líquido produciendo daños celulares. (OCHOA 2011).

La congelación de embriones puede ser realizada en diferentes estados de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de supervivencia, así como también ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelación se evalúa por la observación de la integridad morfológica del embrión en descongelación, la habilidad de clivar in vitro y su capacidad de implantación. (AVILA-PORTILLO 2006)

Los métodos de criopreservación podemos clasificarlos de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación, con protocolos diferentes:

  • Congelación Lenta-descongelación lenta.
  • Congelación Lenta-descongelación rápida en las cuales la adición del crioprotector suele hacerse por pasos y el descenso de la temperatura se realiza lentamente en un congelador programable. La descongelación rápida se hace en poco tiempo a temperatura ambiente o en un baño maría a 30°C para evitar la recristalización.
  • Congelación Ultrarrápida, originalmente descrita para la congelación de embriones, por Trouson en 1986. Implica la rápida deshidratación celular, utilizando altas concentraciones de crioprotector, usualmente DMSO y sacarosa, seguida de inmersión en nitrógeno líquido.
  • Vitrificación; se basa en la congelación rápida en una mezcla de altas concentraciones de crioprotectores, que a bajas temperaturas aumentan su viscosidad formando un sólido amorfo sin formación de hielo. No se requiere la utilización de un congelador programable (AVILA-PORTILLO).

El congelamiento convencional tiene una ventaja comparativa frente a los otros métodos de criopreservación, al ser una metodología que permite la utilización de bajas concentraciones de crioprotectores y permite la transferencia directa de los embriones después de la descongelación. Sin embargo, su habilidad para prevenir la formación de hielo intracelular aún es limitada, además, los resultados in vitro de la criopreservación de embriones han sido variables y menores en comparación a los datos obtenidos en embriones in vivo (DINNYES Y NEDAMBALE 2009).

Hay que tener en cuenta que ningún protocolo de congelación o vitrificación disponible garantiza la integridad total de las estructuras de las células u organismos a criopreservar.

CONGELACIÓN LENTA O CONVENCIONAL.

Esta técnica de CONGELACION LENTA, fue el primer método introducido en  la conservación de embriones bovinos y hoy es el más utilizado comercialmente. Su curva de congelación lenta permiten mantener  el equilibrio entre los factores que pueden causar daño celular, como la formación de cristales de hielo, fractura del embrión, daño tóxico y osmótico, alteración de organelas intracelulares y del citoesqueleto. (VAJTA Y KUWAYAMA 2006).

Básicamente, la congelación/descongelación de embriones consiste en la realización de cuatro etapas:

  1. Suspensión de los embriones en una solución que contiene una sustancia denominada “crioprotector”, cuya finalidad es proteger a los embriones de los efectos perjudiciales del frío.
  2. Congelación propiamente dicha, y almacenamiento en Nitrógeno líquido.
  3. Descongelación de los embriones.
  4. Transferencia (directa o con retiro del crioprotector)

Normalmente, el medio que contiene los embriones se enfría por debajo de su punto de congelación sin formar cristales de hielo, fenómeno conocido como súper-enfriamiento. Luego, a una temperatura más baja, ocurre la formación de núcleos de hielo, seguida por un rápido incremento en la temperatura debido a la liberación del calor de fusión latente.

En la actualidad se prefiere utilizar el Etilenglicol como crioprotector, ya que no necesita ser removido del embrión antes de la trasferencia como sucede con el Glicerol utilizado en un principio. El Etilenglicol a concentración de 1.5 M permite obtener tasas de preñez entre el 50 al 70% postcongelación.

Los embriones seleccionados son  colocados en el medio de congelación a base de PBS suplementado con SFB al 10-20% y 1.0 a 1.5 M de Etilenglicol, a temperatura ambiente (20°C), dejándolos por 8 a 10 minutos para permitir que el crioprotector se equilibre dentro de las células embrionarias.

1 Empacado del embrion

Figura 1. Los embriones se empacan en pajillas francesas de 0.25 a o.5 ml, las cuales se sellan  en su extremo abierto con alcohol polivinilo.

A partir de 2009 más del 99% de los embriones de vacas de carne y leche en los Estados Unidos han sido congelados en Etilenglicol por la American Embryo Transfer Association (AETA) para una Trasferencia Directa TD.

2 Seeding

Una vez empacados los embriones en las pajillas se colocan inmediatamente en la cámara del congelador a una temperatura de -6 a -7°C, dejándose  por 5 minutos, en vapores de nitrógeno, con lo cual se logra el equilibrio.

Para evitar un superenfriamiento extenso, se debe inducir la cristalización del hielo en el medio extracelular más o menos a 2°C por debajo de su punto de congelación (-4 a -7°C),  por medio de la inducción de la formación de un cristal de hielo en el medio. Esto se conoce en inglés como “SEEDING” o “SIEMBRA”.

La inducción de la  cristalización del hielo en el medio extracelular o “SEEDING” se lleva a cabo mediante la aplicación de una pinza hemostática o un topito de algodón preenfriados en el nitrógeno líquido, tocando la pared exterior de la pajilla, teniendo cuidado de no tocar la columna del medio que contiene el embrión. Debe observarse una mancha blanca  por debajo del menisco donde se aplicó la pinza, lo que confirma que el proceso de cristalización se ha efectuado correctamente.

Se recomienda que el proceso de cristalización se realice individualmente y no en conjunto de la totalidad de los embriones a congelar. La técnica correcta es empacar un  embrión, colocarlo en la criocámara e inmediatamente realizar la cristalización de la pajilla en forma individual. Se  deben mantener las pajillas a esta temperatura por 10 minutos más para permitir que la cristalización del medio alcance su equilibrio.

Luego se enfrían los embriones a una tasa de 0.3 a 0.8 °C/min hasta alcanzar una temperatura de entre -30 y -40°C, colocando luego   las pajillas en una cánula plástica para después ser depositadas en un gobelet, para sumergirlas posteriormente en nitrógeno líquido a -196°C dentro de un termo de  congelación y   su almacenamiento.(MAPLETOF).

3 Congelado

Se han desarrollado protocolos estándares de descongelación, de uso ya común para cada uno de los diferentes métodos de criopreservación.

De esta manera se extraen las pajuelas con los embriones congelados del nitrógeno líquido, se mantienen 15 segundos en el aire y a continuación otros 15 segundos a 30 ºC donde descongelan.

Después de esto se secan las pajillas, se quita el  tapón rotulado y, según la técnica de congelación seguida, se someten a una manipulación previa (dilución de la glicerina) o, si son embriones conservados en etilenglicol, se transfieren directamente.

CONGELACIÓN ULTRARÁPIDA. 

Según MUCCI N. et al 2005, los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el método estándar y luego se les deshidrata nuevamente. Se utiliza una solución con 2 a 4,5 Molar de un crioprotector permeable (Glicerol, Propanediol, DMSO o Etilenglicol), y 0,25 a 0,5 Molar de otro no permeable (sacarosa, tetralosa, lactosa).

Esta segunda deshidratación deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajillas son colocadas en el cuello del termo de nitrógeno, durante 5 minutos. Posteriormente son sumergidas al nitrógeno líquido (NL). Los resultados obtenidos fueron dispares, según el estado de desarrollo del embrión congelado.

Otros autores como Díaz, C, et al, 2004 destaca que. La desvitrificación requiere diluir y retirar el agente crioprotector antes de transferir el embrión. Las condiciones de manipulación (temperatura ambiental -39ºC, temperatura de las soluciones de desvitrificación -41ºC-, dilución en soluciones con concentraciones decrecientes de sacarosa) son difíciles de establecer en las granjas, extremo muy importante en el caso del ganado vacuno.

En un próximo artículo se explicará en detalle la técnica de vitrificación de embriones.

Artículo enviado a Prosegan por: Dr. Miguel Germán Rivera Gaona | Email: cuchacho@hotmail.com

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